蝇类是与人类接触密切的重要医学昆虫，是我国重点防控的卫生害虫“四害”之一。蝇类体表多鬃毛，足部爪垫能分泌黏液，喜在人、畜的排泄物、呕吐物及尸体等处爬行觅食，边吃边吐边排泄，容易携带细菌^[1-3]、病毒^[4-5]、寄生虫^[6]等病原体^[7]，是肠道传染病的重要传播媒介^[7]。2019－2021年上海市浦东新区监测捕获的蝇种主要为棕尾别麻蝇（Boettcherisca peregrina）、家蝇（Musca domestica）和丝光绿蝇（Lucilia sericata）。本研究针对浦东新区不同生境捕获的常见蝇种开展肠道病原体研究，旨在了解常见蝇种及其携带肠道病原体情况，为蝇类防制和感染性腹泻病防控提供科学依据。

1　材料与方法

1.1　材料 

1.1.1　样本采集

捕蝇笼、捕蝇挥网，均购自上海无奇科学仪器有限公司。

1.1.2　分类鉴定  

-80 ℃MDF-U54V-PC型超低温冰箱（日本松下）、冰排、医用无菌镊、SMZ800N体视显微镜（日本Nikon）。

1.1.3　蝇类携带肠道病原体检测  

-20 ℃BCD-212型冰箱（德国SIEMENS）、医用无菌剪刀、医用无菌手套、生理盐水、移液枪（德国Eppendorf，10和200 μl、1 ml）、Hank’s液（韩国Sangon Biotech）、蛋白酶K（德国Merck，储存浓度10 mg/ml）、75-2A微量振荡仪（上海医用分析仪器厂）、Wonbio-L高通量组织研磨仪（深圳万科，包含2 ml的研磨管、φ6 mm的研磨珠及铝合金适配器）、5424R超低温高速离心机（德国Eppendorf）、GeneRotex 96全自动核酸提取仪（西安天隆）、qEx-DNA/RNA病毒型核酸提取试剂（西安天隆）、胃肠道感染微流体芯片V3（美国Thermo Fisher Scientific），包括细菌18种：大肠埃希菌（Escherichia  coli）的黏膜性大肠埃希菌（EAEC）、肠出血性大肠埃希菌（EHEC）、肠侵袭性大肠埃希菌（EIEC）、肠致病性大肠埃希菌（EPEC）、肠产毒素大肠埃希菌（ETEC）、产志贺毒素大肠杆菌（STEC）、副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）、创伤弧菌（V. vulnificus）、霍乱弧菌（V. cholerae）、嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）、类志贺邻单胞菌（Plesiomonas shigelloides）、小肠结肠炎耶尔森菌（Yersinia enterocolitica）、空肠弯曲杆菌（Campylobacter jejuni）、结肠弯曲杆菌（Campylobacter coli）、乌普萨拉弯曲杆菌（Campylobacter upsaliensis）、艰难梭菌（Clostridium difficile）、沙门菌（Salmonella）和志贺菌（Shigella）；病毒6种：诺如病毒（Norovirus）、星状病毒（Astrovirus）、札如病毒（Sapovirus）、腺病毒（Adenovirus）、轮状病毒（Rotavirus）和副肠孤病毒（Parechovirus）；寄生虫6种：人芽囊原虫（Blastocystis hominis）、隐孢子虫（Cryptosporidium）、脆弱双核阿米巴（Dientamoeba fragilis）、溶组织内阿米巴（Entamoeba histolytica）、环孢子虫（Cyclospora cayetanensis）和贾第鞭毛虫（Giardia lamblia），Quant Studio 7荧光定量PCR仪（美国Thermo Fisher Scientific）。

1.2　方法

1.2.1　蝇样本采集 

2021年4－11月每月下旬，采用网捕法，在农户、农贸市场、餐饮外环境采集1次家蝇，在公园、居民区、农贸市场采集1次丝光绿蝇和棕尾别麻蝇。将捕获蝇带回实验室，用冷冻法杀死蝇类后分类鉴定，统计各蝇种的数量。

1.2.2　样本预处理

2 ml的研磨管（提前置于-20 ℃冰箱预冷）加入1 ml Hank’s液、15 μl蛋白酶K和2颗研磨珠（提前置于-20 ℃冰箱预冷），加入样品（无菌条件下同一蝇种20只为1组样品，剪成1 mm左右的小块）后，将管子盖严，放入铝合金适配器（提前置于-20 ℃冰箱预冷），室温下，用高通量组织研磨仪研磨0.5 min（55 Hz）。使用超低温高速离心机（离心半径8.4 cm，2 000 r/min，4 ℃）离心4 min，用移液枪吸取200 μl上清液用于核酸提取，剩余样品备用。

1.2.3　肠道病原体PCR检测 

使用全自动核酸提取仪提取核酸，将提取出的核酸与预混液混合后加入胃肠道感染微流体芯片V3，使用Quant Studio 7荧光定量PCR仪开展实时荧光定量反转录聚合酶链式反应（RT-qPCR）实验，参照产品说明书对扩增曲线形态、表示扩增质量的值（Amp Score）、样品反应曲线与阈值线相交的PCR循环数（Cq值）及反映得出的Cq的可靠性的值（Cq Confidence）进行分析，定性检测30种肠道病原体。

1.3　统计学分析

使用Excel 2019软件进行数据整理，所有数据汇入SPSS 22. 0软件进行Pearson c²检验，P<0.05为差异有统计学意义。1管中会检出0-N种病毒、细菌或者寄生虫，1管以检出任意1种细菌、病毒或寄生虫为检出1管病原体。

2　结　果

2.1　病原体检出情况

捕获不同蝇种2 695只，其中家蝇1 544只、丝光绿蝇642只、棕尾别麻蝇509只。家蝇、丝光绿蝇和棕尾别麻蝇的病原体检出率分别为37.29%、67.50%和70.97%，细菌检出率分别为8.47%、45.00%和58.06%，病毒检出率分别为11.02%、42.50%和45.16%，差异均有统计学意义（c²=17.936，P<0.001；c²=44.547，P<0.001；c²=26.519，P<0.001）。家蝇检出11种病原体，主要病原体为人芽囊原虫（占42.37%）、札如病毒（占20.34%）和隐孢子虫（占10.17%）。丝光绿蝇检出12种病原体，主要病原体为产志贺毒素大肠杆菌（STEC，占18.75%）、星状病毒（占13.75%）和札如病毒（占11.25%）。棕尾别麻蝇检出10种病原体，主要病原体为STEC（占22.22%）、星状病毒（占14.81%）和札如病毒（占14.81%）。3个蝇种除副溶血弧菌、诺如病毒和人芽囊原虫的检出率差异无统计学意义（c²=1.216，P=0.544；c²=1.869，P=0.393；c²=5.404，P=0.067）外，其他细菌、病毒和寄生虫检出率差异均有统计学意义。见表1。

2.2　不同季度蝇类携带病原体情况

第2季度家蝇、丝光绿蝇和棕尾别麻蝇的病原体检出率分别为35.14%、86.67%和80.00%（表2），差异有统计学意义（c²=14.492，P=0.001）。家蝇在第3季度检出的细菌和病毒种类最多，检出副溶血弧菌和诺如病毒，未检出EHEC和EPEC；第4季度未检出病毒，寄生虫检出率最高。丝光绿蝇在第2季度检出嗜水气单胞菌；第3季度检出细菌种类最少（仅有STEC），检出病毒种类最多，寄生虫检出率最低，检出腺病毒。棕尾别麻蝇在第3季度检出细菌种类最少（只有EHEC和STEC），检出病毒种类最多，检出诺如病毒。家蝇、丝光绿蝇和棕尾别麻蝇在第4季度人芽囊原虫检出率最高。见图1。

2.3　不同生境蝇类携带病原体情况

农贸市场家蝇、丝光绿蝇和棕尾别麻蝇的病原体检出率分别为36.36%、53.85%和80.00%（表3），差异有统计学意义（c²=6.068，P=0.048）。家蝇在农户中检出3种细菌，检出的病毒种类最多，检出诺如病毒、星状病毒和札如病毒；在农贸市场检出副溶血弧菌；在餐饮外环境检出的细菌种类最多。家蝇在3种生境检出率最高的是人芽囊原虫。丝光绿蝇在3种生境均检出6种细菌和2种病毒，均检出EAEC、EIEC、EPEC、STEC、星状病毒和札如病毒，其中STEC检出率均为最高；在公园和农贸市场检出腺病毒。棕尾别麻蝇在3种生境均检出EAEC、EHEC、EPEC、STEC、星状病毒和札如病毒；在农贸市场检出诺如病毒。除棕尾别麻蝇在公园未检出人芽囊原虫和在居民区未检出隐孢子虫外，其他蝇种这2种寄生虫在各生境均有检出。见图2。

3　讨　论

本研究3种常见蝇类家蝇、丝光绿蝇和棕尾别麻蝇共检出14种病原体，包含8种细菌（EAEC、EHEC、EIEC、EPEC、ETEC、STEC、副溶血弧菌和嗜水气单胞菌）、4种病毒（札如病毒、星状病毒、诺如病毒和腺病毒）和2种寄生虫（人芽囊原虫和隐孢子虫^[8]），主要病原体为STEC、人芽囊原虫和札如病毒。与河南陆港口岸不同^[9]，本次研究的样本虽未检出痢疾杆菌、伤寒杆菌和霍乱弧菌等强致病菌，但检出了可引起食物中毒的病原菌，如EAEC、EHEC、EIEC、EPEC、ETEC和STEC。浦东新区常见蝇种均检出大肠埃希菌，与陈拓^[10]和杨晗晗^[11]的研究结果一致。STEC是一类能产生志贺毒素1型和/或志贺毒素2型的大肠杆菌，包含7种血清型（O157∶H7、O26、O45、O103、O111、O121、O145）。食用被STEC污染的食物可引起腹泻、出血性结肠炎、溶血性尿毒综合征等疾病^[12]。除家蝇在第4季度未检出STEC外，3个蝇种中的STEC均有检出。在3个季度中，丝光绿蝇和棕尾别麻蝇的STEC检出率均最高，应引起重视。国内学者多研究蝇类携带细菌情况，而极少研究其携带病毒情况。此次研究结果3个蝇种均检出札如病毒，该病毒婴幼儿易感。上海东方南院儿科门急诊腹泻患儿粪便标本中检出过札如病毒^[13]。人芽囊原虫是重要的人兽共患水源性寄生虫，目前北京协和医院住院患者及上海市居民的新鲜粪便中均有检出人芽囊原虫^[14-15]，本研究在3个蝇种体内均检出人芽囊原虫，且检出率较高。

国外有研究表明蝇类携带病原体与环境有一定关系。根据蝇类孳生、活动场所的不同，此次常见蝇种的生境选择有所不同。据文献报道，公园捕获的蝇数最多；居民区靠近厕所和垃圾暂存点，也能捕获较多尸食性或腐败食性的绿蝇和麻蝇；农贸市场虽捕获的蝇数最少但是捕获绿蝇^[16]和麻蝇种类较为丰富^[11]。本研究采集丝光绿蝇和棕尾别麻蝇时，选取公园、居民区、农贸市场3类场所进行采样。家蝇成蝇常出入住室，为室内常见蝇种，故本研究选取农户、农贸市场、餐饮外环境3类场所进行采样^[17]。农贸市场家蝇、丝光绿蝇和棕尾别麻蝇的病原体检出率为36.36%、53.85%和80.00%，差异有统计学意义（c²=6.068，P=0.048），说明家蝇较另外2种蝇种携带病原体更少，可能与绿蝇和麻蝇的尸食性或腐食性有关。目前国内外对于蝇类传播副溶血弧菌、嗜水气单胞菌和腺病毒的事件鲜有报道。本研究在农贸市场捕获的家蝇中检出副溶血弧菌，该菌主要寄生于虾、鱼、蟹、贝类、海藻等海产品，是一种海洋细菌，人进食含有该菌的食物也有可能食物中毒，出现腹痛、呕吐、腹泻、排水样便的症状。本研究在居民区捕获的丝光绿蝇中检出嗜水气单胞菌，该菌为我国淡水养殖鱼类暴发性传染病的主要病原菌之一。本研究在公园和农贸市场捕获的丝光绿蝇中检出腺病毒，该病毒主要可引起婴幼儿与4岁以下儿童的胃肠炎，致腹痛、腹泻。本研究在农户捕获的家蝇和农贸市场捕获的棕尾别麻蝇均检出诺如病毒，该病毒目前是上海市浦东新区感染性腹泻的主要原因之一^[18]。

本次蝇类携带病原体的调查表明，家蝇的病原体检出率明显低于丝光绿蝇和棕尾别麻蝇，尸食性或腐食性的丝光绿蝇和棕尾别麻蝇体内的细菌、病毒含量较多。建议：①加强居民的健康教育，提高居民对环境卫生的科学认识，养成良好的卫生行为习惯，以提升浦东新区居民的健康素养；②将居民、公园和农贸市场作为重点防治区域，对其外环境和厕所等进行整治，改善人居环境，以保障居民的饮水、饮食等安全；③加强对病媒生物的监测，并采取有效的措施降低尸食性或腐食性的蝇类密度，科学制定蝇类防控策略，降低肠道疾病的传播风险。

本研究针对家蝇孳生的农户、农贸市场、餐饮外环境3种生境及丝光绿蝇和棕尾别麻蝇孳生的公园、居民区、农贸市场3种生境开展调查研究，发现蝇类携带病原体的种类和数量都十分丰富，且不同蝇种携带的病原体有所不同。本研究也存在一定的局限，如本研究为初次摸底浦东新区的蝇类病原谱，针对性的只做常见蝇种病原体研究，并未开展以自然捕获数为准的所有蝇种的病原体研究；本研究未对3种生境以外的场所开展调查，结果尚不能真实反映浦东新区蝇类体内携带的肠道病原体种类；研究结果尚不能证实蝇类携带病原体与人群感染性腹泻病之间存在必然关联，尚需要加强人群监测和统一检测标准，并且进一步开展相关性分析。下一步的研究将侧重于开展更多样本检测并采用基因组序列分析来评估病原体的传播和接触途径。

林晨1,2，刘俊1,2，于思雨1,2，元永艇1,2，刘婧怡1,2，陆馨晨1,2，胡晨曦1,2，刘洪霞3，刘汉昭1,2

1. 上海市浦东新区疾病预防控制中心病媒生物控制与寄生虫病防治科，上海 200136；2. 复旦大学浦东预防医学研究院，上海 200136；3. 上海市疾病预防控制中心病媒生物防治科，上海 200336