蠓是种“肉眼看不见的血吸虫”，由于体型微小（1-3 mm)，经常在白天或夜间猝不及防地攻击人畜和鸟类（虞以新，2006a；Borkent和Dominiak，2020)，通过雌蠓持续叮咬吸血可传播一些病毒、原虫和丝虫等病原体，如：感染人的奥普切罗热和丝虫病、反刍动物间的蓝舌病和出血热、马科动物间的非洲马瘟等（Mellor等，2000；Mullen & Murphree 2019)。过去十年间，吸血库蠓传播的蓝舌病毒和施马伦贝格病毒，使欧洲的畜牧业遭遇了巨大的经济损失（Koenraadt等，2014)。

除蠛蠓属外，铗蠓亚科均为非吸血蠓类，是蠓科昆虫中第二大类群，也是热带和亚热带地区一些植物重要的传粉昆虫（de Meillon & Wirth，1991)。数量极为庞大，是多数地区主要优势种，而且大多喜欢白昼活动。

西湖蠓类也以铗蠓和毛蠓属为主，尽管这些非吸血蠓体型微小、无法叮咬，但6.39平方千米西湖触手可及的庞大数量严重影响了游客的生活与休憩，如果说一只蠓是叮咬人类最小的奇虫，那么一千只蠓甚至更多则可以构成人间地狱（Kettle，1962)，以致每年不时有游客对西湖蠓类的危害进行投诉。

为及时了解西湖吸血蠓与非吸血蠓种群组成结构，及时掌握蠓类危害动态，探明西湖蠓类主要优势种，通过细胞色素C氧化酶亚基I(cytochrome oxidase subunit I，COI）和rDNA内转录间隔区（internal transcribed spacer 1，ITS-1）基因，进一步了解本地区主要蠓种遗传差异（Mathieu等，2007；Morag等，2012；Harrup等，2016)，以便进一步了解其与国际基因文库相关物种系统发育关系，全面了解其在西湖整个生态系统中的作用。

1  材料与方法

1.1 样品采集

主要采用光诱捕法（功夫小帅，武汉吉星科技有限公司），2017-2018年5-11月期间，选取杭州西湖风景名胜区9个具有典型生境的景点：湖滨管理处、钱王祠、三潭印月、湖心亭、郭庄、曲院风荷、灵隐寺、灵隐中队、植物园等作为监测点，每个监测点放置2盏诱捕器。诱捕器距的高度约为2 m，每月上中旬诱集一次，每次诱集时间为24小时（当日9:00～翌日9:00)。

翌日将收集到的样本用乙醚麻醉后，经初步形态观察分离后，用眼科镊子轻轻地将收集袋中的成虫装入75%酒精的0.25 ml离心管中，放入－4℃冰箱保存备用。

1.2 蠓种形态学鉴定

主要采用标片法，参照虞以新（2006b)、Borkent和Spinelli(2007)，依次通过“割翅－腐蚀（5%氢氧化钠－漂洗－脱水（系列梯度酒精－封片（加拿大树胶：二甲苯=2:1)”等流程，最后将制作完成的标本置放于阴凉处或45℃-50℃烘箱中进行干燥。所用仪器设备为SmartZoom 5体视显微镜和AX10 Imager A1生物显微镜（Zeiss，德国）。

1.3 优势种指数确定

根据制片与分类镜检结果，分别统计分析捕获率（R)、月叮咬率（M）和优势种指数（d）等主要参数，探明西湖风景名胜区究竟存在哪些蠓类、优势地位及其种间竞争能力。

1.4 DNA提取

选取西湖主要优势种，首先将5只雌虫（XH01-5拜氏铗蠓Forcipomyia bikanni，2017年8月和10月均采自于植物园）置于液氮中，充分研磨后，然后按照Wizard Genomic DNA Purification Kit(Promega，北京）试剂盒操作说明，提取DNA，-20℃冷冻保存备用。

1.5 PCR扩增

参照Morag等（2012)，主要检测蠓类COI(600 bp）和ITS-1 (400 bp）两大基因，所用引物依次为COI: C1-J-1718m 5‘-GGAGGATTTGGAAATTGATTAGT-3’和C1-N-2191m 5'-CAGGTAAAATTAAAATATAAACTTCTGG-3'；ITS-1: PanCulF 5'-GTAGGTGAACCTGCGGAAGG-3' 和 PanCulR 5'-TGCGGTCTTCATCGAACCCAT-3' 。PCR扩增主要选用Green Taq Mix试剂盒（Vazyme，南京），反应体系包括2 µL DNA、1 µL 10 µM上游引物或下游引物和12.5 µL Green Taq Mix混合液，共25µl。

将配制好的反应液置于S1000^TM PCR仪（Bio-Rad，美国）中：94℃预变性5 min；94℃变性1 min、53℃退火30 sec、72℃延伸30 sec ，共30个循环；72℃延伸10 min。再将基因扩增后的PCR产物置于1.5%的琼脂糖凝胶中进行电泳（100 V,25 min)，然后将胶条置于Bio-Rad Gel Doc^TM EZ System凝胶成像仪（Bio-Rad，美国）进行观察。

1.6 序列分析

将扩增后的PCR产物经擎科（杭州）生物科技有限公司纯化与测序后，获得所需的基因序列。然后打开MEGA 10.1.7(Kumar等，2018；Hall，2018)，从主窗口“Align”菜单选择“Do BLAST Search”，利用MEGA中的网页浏览器自动连接到美国国家生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI，）)进行BLAST核酸序列比对，在“Query sequence”输入测序序列，选择“blastn”查找亲缘关系较远的序列。在Algorithm parameters中挑选E（(Expect threshold≤10^-）)并且与查询序列长度约有90%重叠的序列，然后通过MEGA主菜单中的“Models”，选择“寻找最好的DNA/蛋白质ML模型”建立系统发生树，探索西湖主要蠓类相关基因序列地理溯源。为了估计可靠性，在“分析参数设置”窗口，选择“自展法Bootstrap”计算1000次重复。

2 结  果

2.1 蠓种组成结构

经镜检观察与制片分析，2017-2018年期间捕获到的西湖蠓类共分蠓亚科、毛蠓亚科、铗蠓亚科3亚科，约7属12种，其中蠓亚科包括4属：库蠓属、须蠓属、贝蠓属、柱蠓属；铗蠓亚科有铗蠓属和裸蠓属2属；毛蠓亚科仅毛蠓属，其中吸血蠓类只有库蠓属中的北京库蠓和秀茎库蠓2种（表1)。

表1.  西湖名胜风景区主要蠓种名录

该地区主要优势种为非吸血蠓——拜氏铗蠓，其数量约占整个捕获蠓类总量的52.3%，居于绝对的优势地位。其次为毛蠓属Dasyhelea sp.1^#和Dasyhelea sp.2^#所占比例为13-15%；再次为裸蠓属Binipenis sp.约占总数的6.5%。而吸血蠓仅为北京库蠓和秀茎库蠓2种，前者所占比例为3.7%，后者不足1%，在中间竞争中处于劣势地位，且月叮咬率（MBR）不足5%，每小时每盏灯捕获的数量也不足1只（R=0.04)，致使总体危害水平较轻，远远低于理论的（图1)。

2.2 蠓种动态变化规律

拜氏铗蠓在9个监测点中均有分布，为广布种，其中捕获数量最多的是曲苑风荷；其次为毛蠓属和裸蠓属，也是各个监测点主要种类之一。而秀茎库蠓、弯胫须蠓、万源贝蠓则分布较为狭窄，仅在2-3个监测点存在。虽然从捕获数量来看，曲苑风荷蠓类数量最多，但从蠓种多样性来看，无疑是植物园，这与植物园优美的环境、丰富的植被、适宜的土壤等分不开。三潭印月由于独处孤岛，物种特别单一，仅3种。而湖心亭虽然也是湖中孤岛、人迹罕至，但蠓种却多达6种。说明不同生态类型，蠓种的分布也不尽相同，生态环境的好坏也决定了蠓种的多样性。

根据季节性消长趋势，西湖蠓类危害呈典型的双峰型，8月和10月是其活动高峰，这一点与拜氏铗蠓活动规律完全一致（图2)，5-8月随着气温的逐渐升高而活动频繁，但至11月后随着气温的进一步降低，蠓类的危害逐渐减弱，但少数监测点仍然可见蠓类活动。裸蠓属、须蠓属、贝蠓属、柱蠓属仅限于8月份以前，附突铗蠓仅在9-11月活动，而拜氏铗蠓、北京库蠓和毛蠓属绝大多数种类，常年基本上都有活动。

2.3 基因测序与序列分析

经凝胶成像检测与基因公司测序后，所得XHO1-5拜氏铗蠓COI基因大小为523 bp；ITS-1为315 bp。

2.3.1 COI基因序列分析

通过NCBI数据库中的BLASTN序列检索，选择GenBank中相似度≥86%和E期望值低于0.1%以下的65个具有代表性的序列进行比对，包括3种铗蠓属与4种库蠓属，如：Ceratopogonidae sp.(HQ979089、KC502145)；尖喙库蠓（JN545045、JN545047)；薛采库蠓 (Cu. schultzei，MF399699)；索诺拉库蠓（Cu. sonorensis，KT794144、 KY707833、LN484060)；Cu. variipennis(KT794138)；Fo. bipunctata(HQ981469、JF867837、KJ768005、KR649517、KT099530、MG171510）等。

首先通过MEGA主菜单中的“Models”，选择“寻找最好的DNA/蛋白质ML模型”，根据赤池信息准则（Akaike Information Criterion，AICc)、对数似然值（log likelihood，InL）和贝叶斯信息准则（Bayesian information criterion，BIC)3种不同适合度检验结果，从最大似然法24种不同组合中选择总时间可逆模型（GTR）来构建最能准确代表序列的分支历史演化次序的系统树（图3)。结果发现上述DNA序列均来自同一祖先，Fo. bikanni (XH01-5）虽然与编号LC015045来自福建的拜氏铗蠓COI基因序列高度相似（97.9%，图3)，但两者分支界线较为明显（截止值95%)。

2.3.2 ITS-1基因序列分析

同样方法。对于ITS-1基因，选择GenBank相似度高于92%、E期望值低于0.1%的43个具有代表性的序列进行比对：琉球库蠓 (Cu. actoni，AB462259、MK892990、MK892991、MK892992)；Cu. alachua (MK892993)；短跗库蠓（Cu. brevitarsis,MK893000)；环斑库蠓（KJ818243)；Cu. fulvus (MK893006、MK893007)；Cu. grahamii (MK893008、MK893009)；Cu. loxodontis (MK893022)；婚飞库蠓 (Cu. maritimus，AJ417981)；Cu. obscurus (MK893029、MK893030、MK893031)；不显库蠓（Cu. obsoletus，MK893032、MK893033、MK893034、MK893035)；冲绳库蠓（KY552922)；尖喙库蠓（JN408476)；帕罗库蠓（Cu. parroti，KF178260)；Cu. pseudopallidipennis (MK893038)；Cu. punctatus (AY861157)；Cu. sanguisuga (MK893042、MK893043)；薛采库蠓（Cu. schultzei，JN408474、JN408475、JN408477)；苏格兰库蠓（Cu. scoticus，MK893044、MK893045)；兴安库蠓（Cu. sinanoensis，MK893047)；Culicoides sp. (KY620882)；Cu. tuttifrutti (MK893050)；累赘库蠓（Cu. verbosus，AB462281)；Fo. peregrinator (HM775508、HM775509)；Forcipomyia sp. (HM775506)；Fo. townsvillensis (HM775502、 HM775503、HM775504、HM775505)。

仍然选择最大似然法中的GTR进行构建无根树，虽然上述45个基因均来自同一祖先。拜氏铗蠓XH01-5与环斑库蠓（KJ818243)、冲绳库蠓（KY552922）和Fo. townsvillensis (HM775502、HM775503、HM775504）同源性高达98%，但属于不同的进化分支，但仅与尖喙库蠓（JN408476）处于同一分支（图4)。

3 讨  论

从动物地理区划来看，浙江属于东洋界。从气候上来说是亚热带和热带，铗蠓属在全世界广为分布。从习性来看，拜氏铗蠓较为喜欢温暖湿润环境，西湖得天独厚的环境也非常有利于其生存，一些堤岸、石窟、洞穴、泥沼地、半湿地、滩涂、树洞、苔藓、藻类、腐烂的木头或植物茎，给蠓虫的交配产卵、繁育后代、迁飞扩散等提供了理想的栖息和繁衍场所，尤其是真正的严冬季节比较短暂。但国际上，拜氏铗蠓仅在新加坡有分布，国内也仅河南、福建、广东、广西、四川等（虞以新等，2006；Borkent，2020)，分布区较为狭窄。

根据COI基因序列分析结果，浙江拜氏铗蠓与编号LC015045的邻近省份福建拜氏铗蠓基因序列，虽然在系统发育树上处于不同的分支，但从地源上看浙江与福建在温度、湿度、植被、生境等方面存在一定的重叠性。

从检测结果看，无论是COI还是ITS-1基因序列分析，拜氏铗蠓XH01-5均与来自以色列的尖喙库蠓（JN408476；Morag等，2012）处于同一分支，充分说明本研究通过最大似然法和GTR模型构建的无根系统发育树是非常成功的。从侧面也充分说明了，COI与ITS-1基因不仅有助于了解该物种的地理溯源性，在协助形态鉴定方面具有一定的参考价值（Mathieu等，2007；Morag等，2012；Harrup等，2016；Hakima等，2020)。

本研究中的基因序列也将实时上传至Barcode of Life Data System (BOLD）和NCBI GenBank核酸数据库。

金虹¹，张海珍²，杨天赐³

1杭州卫康有害生物防治有限公司，浙江 杭州 310020；

2杭州植物园，浙江 杭州 310000；

3杭州国际旅行卫生保健中心（杭州海关口岸门诊部），浙江 杭州 310012

参 考 文 献

1.  虞以新. 中国蠓科昆虫（昆虫纲，双翅目） 第一卷[M]. 北京： 军事医学科学出版社， 2006a.

2.  虞以新. 中国蠓科昆虫（昆虫纲，双翅目） 第二卷[M]. 北京： 军事医学科学出版社， 2006b.

3.  Hall, B.G.著. 陈士超， 吴晓运译（2018). 轻松构建系统发育树实用操作方法和理论 （第4版）. 北京： 高等教育出版社.

4.  Borkent, A. & Dominiak, P. (2020). Catalog of the biting midges of the world (Diptera: Ceratopogonidae). Zootaxa, 4787(1): 1-377.

5.  Borkent, A. & Spinelli, G.R. (2007) Aquatic biodiversity in Latin America—Volume 4--Neotropical Ceratopogonidae (Diptera: Insecta). Bulgaria: Sofia-Moscow: Pensoft, 34-128.

6.  Hakima, B. Hwang, H.-S. Lee, K.Y. (2020) Molecular identification of Culicoides (Diptera: Ceratopogonidae) species in Algeria. Acta Tropica, 202: 105261. https://doi.org/10.1016/j.actatropica.2019.105261. [accessed on 1 June 2019].

7.  Harrup, L.E. Laban, S. Purse, B.V. Reddy, Y.K. Reddy, Y.N. et al. (2016) DNA barcoding and surveillance sampling strategies for Culicoides biting midges (Diptera: Ceratopogonidae) in southern India. Parasites & Vectors, 9:461.DOI 10.1186/s13071-016-1722-z. [accessed on 1 June 2019].

8.  Kettle, D.S. (1962) The bionomics and control of Culicoides and Leptoconops (Diptera, Ceratopogonidae = Heleidae). Annual Review of Entomology, 401-418.

9.  Kumar, S. Stecher, G. Li, M. Knyaz, C. & Tamura, K. (2018) MEGA X: Molecular Evolutionary Genetics Analysis across computing platforms. Molecular Biology and Evolution, 35: 1547-1549.

10.      Mathieu, B. Perrin, A. Baldet, T. Delécolle, J.-C. Albina, E. & Cêtre-Sossah, C. (2007) Molecular identification of western European species of Obsoletus complex (Diptera: Ceratopogonidae) by an internal transcribed spacer-1 rDNA multiplex polymerase chain reaction assay. Journal of Medical Entomology, 44(6): 1019-1025.

11.      Mellor, P.S. Boorman, J. & Baylis, M. (2000) Culicoides biting midges: their role as arbovirus vectors. Annual Review of Entomology, 45: 307-340.

12.      Morag, N. Saroya, Y. Braverman, Y. Klement, E. Gottlieb, Y. (2012) Molecular identification, phylogenetic status, and geographic distribution of Culicoides oxystoma (Diptera: Ceratopogonidae) in Israel. PLoS ONE, 7(3): e33610. doi:10.1371/journal.pone.0033610. [accessed on 1 June 2019].

13.      Mullen, G.R. & Murphree, C.S. (2019) Biting midges (Ceratopogonidae). Medical and veterinary entomology, 3rd edn (ed. by G.R. Mullen & L.A. Durden). Academic Press, London, pp. 213-236.